Versuch
II,
3
Induktion
der Nitratreduktase in Rettich-Kotyledonen
Die meisten höheren Pflanzen nehmen Stickstoff in Form von anorganischen Stickstoffverbindungen (NH4+ oder NO3-) auf. NO3- wird von der Nitratreduktese im Cytosol zu NO2- reduziert. NO2- wird anschließend von dem Enzym Nitritreduktase in den Plastiden zu NH4+ reduziert. Für diese Reaktion wird Ferredoxin als Elektronendonator benötigt. Sowohl die Nitrat-, als auch die Nitritreduktase sind durch ihre Substrate induzierbar.
Das entstandene Nitrit wird mit einer spezifischen Farbreaktion (mit Sulfanilsäure- und NED-Reagenz) nachgewiesen.
Mit Hilfe einer erstellten Eichkurve läßt sich Anhand einer photometrischen Messung die Menge des entstandenen Nitrits, und somit die Aktivität der Nitratreduktase bestimmen.
Versuch:
Kotyledonen von Rettichkeimlingen werden unterschiedlich lang in einer Nitritlösung inkubiert. Nach Herstellung eines Rohextraktes wird mit Hilfe einer photometrischen Messung die Enzymaktivität bestimmt.
Durchführung (im Detail siehe Skript):
Vier Ansätze mit jeweils 1,5g zwei Tage alter Rettichkotyledonen wurden in je 25 ml einer 50mM KNO3-Lösung nach zweimaliger Vakuumfiltration auf einer Schüttelmaschine mit Zusatzbeleuchtung inkubiert.
Nach 0, 1, 2 und 3.5 Stunden Inkubationszeit wurde ein Rohextrakt hergestellt, aus dem dann die Enzymaktivität (Nitratreduktaseaktivität) gegen einen Leerwert gemessen wurde.
Das entstanden Nitrit wurde im Anschluß darauf mit einer spezifischen Nachweisreaktion nachgewiesen und quantitativ mit Hilfe einer photometrischen Messung (bei 538 nm) bestimmt.
Ergebnis:
Berechnung der Nitrit-Menge:
gegeben: 40 mm NO2-Standard
allgemein: 2,76 x 10-3 g / l
Resultat bei t = 0 h: 0,56 ml Þ 1,5456 mg Þ 0,0336 mmol Þ 0,0224 mmol/g
Resultat bei t = 1 h: 0,68 ml Þ 1,8768 mg Þ 0,0408 mmol Þ 0,0272 mmol/g
Resultat bei t = 2 h: 0,60 ml Þ 1,6560 mg Þ 0,0360 mmol Þ 0,0240 mmol/g
Resultat bei t = 3,5 h: 0,64 ml Þ 1,7660 mg Þ 0,0384 mmol Þ 0,0256 mmol/g
blau: Kurve mit Wert von t = 1 h
pink: Kurve ohne Wert von t = 1 h
Allgemein lässt sich sagen, dass je länger die Inkubationszeit ist, umso mehr Nitrat wurde umgesetzt zu Nitrit. Der zweite Wert ist aus unbekanntem Grund sehr hoch und aus diesem Grund nicht in die Auswertung miteinbezogen werden. In den letzten 1,5 Stunden wurde genausoviel Nitrat umgesetzt wie in den ersten zwei Stunden. Die Nitratreduktase braucht offensichtlich eine gewisse „Anlaufzeit“ der Substratinduktion, um optimal zu arbeiten.