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Versuch 9: Chromatographie 

Versuch IX A: Isolierung und Chromatographie der Chloroplastenfarbstoffe

Mit Hilfe der Chromatographie lassen sich Substanzgemische auftrennen. Dabei nutzt man die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der einzelnen Komponenten aus. Man unterscheidet grundsätzlich vier Formen, die Verteilungs-, Adsorptions-, Ionenaustausch-chromatographie und die Gelfiltration, wobei diese entweder in Säulen, auf Dünnschichtplatten oder an anderen präparativen Trägern durchgeführt werden können.

 

In diesem Versuch sollten die Pigmente der Chloroplasten mittels verschiedener Verteilungssysteme verglichen werden.

 

1.   Extraktion

 2 g Kleeblätter wurden unter Zugabe von Kalziumcarbonat, Aceton und Benzin zerrieben. Anschließend wurde die Mischung über eine Glasfritte abfiltriert und die pigmenthaltige Lösung in einen Scheidetrichter gegossen. NaCl-Lösung zur Herabsetzung der Oberflächenspannung wurde dazu geschüttet, wodurch sich die Pigmente besser in die Benzinphase überführen liessen. Nach Schwenken des Trichters konnte man nun die untere gelbe Aceton-Wasser-Phase ablassen. Die verbliebene Benzinphase wurde mit Wasser gewaschen und dann in einem Erlenmeyerkolben solange mit Natriumsulfat versetzt, bis keine Klumpen mehr gebildet wurden. Dadurch wurde das Wasser entzogen.

2.   Säulenchromatographie

Auf die mit Stärke gefüllte Säule wurden unter schwachem Sog der Wasserstrahlpumpe ca. 2 ml der Lösung gebracht. Sobald diese vollständig eingedrungen war, wurde sie mit Benzin nachgewaschen, und dann mit einem Entwicklergemisch aufgetrennt. Dabei musste darauf geachtet werden, dass die Säule nie trocken läuft, da Sauerstoff die Farbstoffe zerstört.

Es hätten sich von oben nach unten folgende Banden ergeben sollen (in Klammern: nicht sichtbar): Neoxanthin, (Chlorophyll b,) Chlorophyll a, (Violaxanthin,) Lutein, ß-Carotin.

ß-Carotin, Lutein und Chlorophyll a hätten getrennt in Reagenzgläsern aufgefangen werden sollen. Doch die gelben Farbstoffe Lutein und ß-Carotin ergaben anscheinend nur eine gemeinsame Bande, so dass erst die Messung des Absorptionsspektrum (siehe 3.) Aufklärung über die tatsächlich aufgefangenen Pigmente liefern würde.

3.   Absorptionsspektrum

Das Absorptionsspektrum wurde mit einem selbstregistrierenden Photometer gegen Benzin ermittelt (siehe beigefügte Graphiken).

Zuerst wurde die Probe der untersten Bande, die wahrscheinlich ß-Carotin und Lutein enthielt, untersucht. Der Vergleich des Spektrums (Skript) mit dem aufgenommenen Spektrum zeigt, dass die Maxima der Probe genau denen des Luteins entsprechen. Man kann aber nicht ausschließen, dass eine geringe Verunreinigung mit ß-Carotin vorliegt, da die beiden Pigmente in etwa die gleichen Maxima besitzen (425, 450, 475 nm).

Die zweite Probe weist  zwei Maxima auf, bei etwa 420 und 670 nm, was eindeutig bestätigt, dass Chlorophyll a vorlag.

 

4.   Dünnschichtchromatographie

 

a) Das Farbstoffgemisch wurde auf einer „Kieselgel 60“-Folie aufgetrennt. Dazu wurden im Abstand von 2 cm portioniert Farbmengen von 3, 18 und 90 µl aufgetragen, so dass das Lösungsmittel vor weiterem Auftrag erst verdampfen konnte. So entstanden drei kleine Auftragstellen mit steigenden Mengen, wodurch ein Verwischen der einzelnen Bandengrenzen bei eventuell zu hoher Menge vermieden werden sollte. Die Platte wurde in eine mit Laufmittel gefüllte Trennkammer gestellt. In den nächsten 1,5 h stieg das Laufmittel langsam von  der Startlinie empor und zog die einzelnen Farbstoffe entsprechend ihrer Polarität mit unterschiedlicher Geschwindigkeit mit.

Folgendes Trennungsbild sollte sich ergeben:

Neoxanthin, Violaxanthin, Lutein, Chlorophyll b, Chlorophyll a, Phaeophytin a, ß-Carotin.

Tatsächlich waren bei der höchsten Substanzmenge nur vier Banden zu sehen:

vermutlich Lutein, Chlorophyll b, Chlorophyll a, Phaeophytin.

Bei mittlerer Menge ergaben sich nur zwei Banden, wahrscheinlich die beiden Chlorophylle, und bei 3 µl zeigte sich gar keine Bande. Die Pigmentkonzentration unserer Lösung war anscheinend sehr niedrig, so dass es vielleicht sogar sinnvoll gewesen wäre, noch mehr aufzutragen.

b) Im Trennungssystem mit reversen Phasen wurden die Proben auf den nicht imprägnierten Teil der Platte aufgetragen. Dieser Teil wirkt als Konzentrierungszone, so dass die Pigmente als scharfe Zone bis zur Imprägnierung mitgenommen werden. Danach wurden sie aufgetrennt, und zwar in umgekehrter Reihenfolge wie oben.

Auf Grund der geringen Pigmentmenge waren nur drei Banden zu erkennen:

Lutein, Chlorophyll b, Chlorophyll a

 

Die vorhandenen Banden waren dünn und balkenförmig im Gegensatz zur obigen Methode (a), wo es sich bei den Banden eher um runde Flecke handelt, die leicht ineinander übergehen können.

 

Nur zur Auftrennung sind die Dünnschichtchromatographien sicherlich besser geeignet, da die Banden deutlicher sind. Will man aber die Substanzen weiter untersuchen, müsste man sie umständlich vom Träger eluieren. In diesem Fall stellt die Säulenchromatographie die bessere Alternative dar, da größere Mengen des Farbstoffs einfach aufgefangen werden können.

 

 

Versuch IX B: Ionenaustausch-Chromatographie von Phycobiliproteinkomplexen des Cyanobakteriums Mastigocladus laminosus an DEAE-Säulen

 

Phycobilisomen der Cyanobakterien sind als supramolekulare Komplexe an der Außenseite der Thylakoidmembranen gebunden, wo sie mit den Photosystem II-Komplexen assoziiert sind.

Sie bestehen aus verschiedenen Untereinheiten: dem Allophycocyanin(AP)-zentrum („core“) und peripher angeordneten „rods“, die Phycocyanin (PC) und oft auch Phycoerythrin (PE) bzw. Phycoerythrocyanin (PEC) enthalten. Die Einteilung in diese verschiedenen Klassen erfolgte entsprechend ihrer spektralen Eigenschaften.

 

Der Versuch wurden mit Hilfte eines Diethylaminoethyl (DEAE)-Anionenaustauschers durchgeführt. Als stationäre Phase diente DEAE-Trisacryl, als mobile Phase 10 mM Diammoniumhydrogen-Phosphat-Puffer.

Die Probe, bestehend aus Phycobilisomen-Dissoziat von Mastigocladus laminosus, wurde nun auf die Säule aufgetragen. Anschließend konnte mit den Elutionen begonnen werden. Die einzelnen Fraktionen wurden in Eppendorf-Cups aufgefangen.

 

1.   Elution (10 mM (NH4)2HPO4): PEC (rosa)

2.   Elution (30 mM (NH4)2HPO4): AP (hellblau)

3.   Elution (400 mM (NH4)2HPO4): PC (dunkelblau)

 

Danach musste die Säule wie im Skript beschrieben regeneriert werden.

 

Die Proteinfraktionen konnten im automatischen Spektrometer an Hand ihrer Absorptionsmaxima identifiziert werden (siehe beigefügte Graphiken):

 

1.   Elution (Graphik verkehrt herum, da Probe und Referenz vertauscht wurden):

PEC Emax : theoretisch ca. 575 nm,

gemessen: ca. 590 nm

 

2.   Elution:

AP Emax : theoretisch ca. 650 nm,

gemessen: ca. 610 nm

Das gemessene Maximum weicht beträchtlich vom Idealwert ab, evtl. liegt eine Verunreinigung vor oder der Wert wurde durch ein Trockenlaufen der Säule verfälscht.

 

3.Elution:

PC Emax : theoretisch ca. 620 - 630 nm,

gemessen: ca. 560 nm

Der falsche Wert resultiert hier wahrscheinlich aus einer Verunreinigung der Probe mit PE, dessen Emax  bei 550 - 575 nm liegt.

 

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Versuch 9: Chromatographie

A: Isolierung und Chromatographie der Chloroplastenfarbstoffe

 

Durchführung

Blätter werden mit CaCO3 (Puffer), Benzin und Aceton (anaerob) zerkleinert und abfiltriert. Die Pigmente werden im Scheidetrichter von der wässrigen Phase (Saft mit NaCl) in die Organische Phase (Benzin) überführt. Das restliche Aceton wird ausgewaschen, und das Wasser mit Na2SO4 entfernt.

 

a) Säulenchromatographie:

Die Farbstofflösung wird auf eine mit Stärke gefüllte Säule aufgebracht und mit Entwicklergemisch getrennt. Die Banden mit ß-Carotin, Lutein und Chlorophyll a sollten aufgefangen werden, die ß-Carotin-Bande war aber nicht sichtbar.

 

b) Dünnschichtchromatographie

Die Farbstofflösung wird auf eine Kieselgel 60- Folie und auf den nicht-imprägnierten Teil einer Folie aufgetragen bei der mit Reversen Phasen getrennt wird. Beide Folien werden in Schwachlicht in Feuchtigkeitskammern in der jeweiligen Laufmittellösung gestellt.

 

c) Absorptionsspektrum

Von den aufgefangenen Proben aus a) wird ein Absorptionsspektrum zwischen 400 und 500 nm erstellt.

 

Ergebnis

b) Die Probe auf der Kieselgel-60 Folie zeigte die Banden in folgender Reihenfolge:

-        Start

 

-        Neoxanthin

 

-        Violaxanthin

 

-        Lutein

 

-        Chlorophyll II b

-        Phaephytin b (nicht gut getrennt, war bei Chlorophyll II b dabei)

-        Chlorophyll IIa

-        Phaephytin a

 

 

-        Carotin ß

 

Leider ist der Streifen völlig verblasst, so dass man jetzt überhaupt nichts mehr darauf sieht.

Das Reverse Phasen-System zeigt kaum erkenntliche gelb-grünliche Flecken, keine Banden.

 

c) Absorptionsspektrum siehe Anlage I und II (Ausdruck)

 

 

 

Diskussion

b) Die Auftrennung der Banden bei der ersten Folie gelang mustergültig, nur Chlorophyll II b und Phaephytin b lagen übereinander und gaben eine Mischfarbe. Wären die Proben noch etwas länger gelaufen, hätte sich das auch noch aufgetrennt.4

Die Reverse Phase ist beim einlegen leider kurz in die Lösung gefallen, weswegen wohl die Probe etwas verwaschen wurde.

 

c) Die erhaltenen Absorptionsspektren entsprechen relativ gut den Bekannten Eigenschaften der Isolierten Stoffe. Das zweite Maximum bei Chlorophyll b liegt bei 650 nm und ist nicht mehr auf dem Ausdruck enthalten.

Beim Lutein ist bei 480 nm ein eigenartiger Einbruch, ansonsten entspricht auch dieses Spektrum den bekannten Absorptionseigenschaften.

a) Dies lässt darauf schließen, dass die Auftrennung bei relativ gut gelungen ist (außer bei ß-Carotin)

 

B: Ionenaustausch-Chromatographie von Phycobiliproteinkomplexen des Cyanobakteriums Mastigocladus laminosus an DEAE-Säulen

 

Durchführung

Ein fertig gereinigtes Aliquot mit Phycobiliproteinkomplexen wurde auf eine DEAE-Säule aufgetragen. Die Probe wurde dann mit verschiedenen Konzentrationen des Elutions-Puffers (NH4)2PO4 Eluiert, wobei die verschiedenen Fraktionen der Komplexe getrennt wurden.

 

Ergebnis

1.     Elution (10mM Puffer):

Hier sollten die Phycoerythrocyanine eluiert werden, da diese nicht an die Matrix binden. Das Eluat sollte rosa sein, war es aber nicht und wie Anlage I zeigt, ist in der Isolierten Fraktion irgendetwas, jedoch kein PEC vorhanden.

2.     Elution  (30 mM Puffer):

Das Eluat wird hellblau, es werden AP eluiert. Absorptionsspektrum siehe Anlage II

3.     Elution (400 mM Puffer):

Hier werden PC isoliert, das Eluat ist dunkelblau. Absorptionsspektrum siehe Anlage III

 

Diskussion

Bei der ersten Elution lag offensichtlich Verunreinigung vor, oder die Fraktion wurde zu früh entnommen, so dass die PEC noch nicht da waren. Jedenfalls zeigte das Photometer keine deutliches Absorptionsmaximum.

Elution 2 und 3 waren hingegen erfolgreich, die Spektren zeigen Absorptionsmaxima bei 650 nm (für AP) und bei 630 nm (für PC).

 

 

 

 

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