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Versuch 9: ChromatographieVersuch
IX A: Isolierung und Chromatographie der Chloroplastenfarbstoffe Mit
Hilfe der Chromatographie lassen sich Substanzgemische auftrennen. Dabei nutzt
man die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der einzelnen Komponenten
aus. Man unterscheidet grundsätzlich vier Formen, die Verteilungs-,
Adsorptions-, Ionenaustausch-chromatographie und die Gelfiltration, wobei diese
entweder in Säulen, auf Dünnschichtplatten oder an anderen präparativen Trägern
durchgeführt werden können. In
diesem Versuch sollten die Pigmente der Chloroplasten mittels verschiedener
Verteilungssysteme verglichen werden. 1. Extraktion
2
g Kleeblätter wurden unter Zugabe von Kalziumcarbonat, Aceton und Benzin
zerrieben. Anschließend wurde die Mischung über eine Glasfritte abfiltriert
und die pigmenthaltige Lösung in einen Scheidetrichter gegossen. NaCl-Lösung
zur Herabsetzung der Oberflächenspannung wurde dazu geschüttet, wodurch sich
die Pigmente besser in die Benzinphase überführen liessen. Nach Schwenken des
Trichters konnte man nun die untere gelbe Aceton-Wasser-Phase ablassen. Die
verbliebene Benzinphase wurde mit Wasser gewaschen und dann in einem
Erlenmeyerkolben solange mit Natriumsulfat versetzt, bis keine Klumpen mehr
gebildet wurden. Dadurch wurde das Wasser entzogen. 2. Säulenchromatographie Auf
die mit Stärke gefüllte Säule wurden unter schwachem Sog der
Wasserstrahlpumpe ca. 2 ml der Lösung gebracht. Sobald diese vollständig
eingedrungen war, wurde sie mit Benzin nachgewaschen, und dann mit einem
Entwicklergemisch aufgetrennt. Dabei musste darauf geachtet werden, dass die Säule
nie trocken läuft, da Sauerstoff die Farbstoffe zerstört. Es
hätten sich von oben nach unten folgende Banden ergeben sollen (in Klammern:
nicht sichtbar): Neoxanthin, (Chlorophyll b,) Chlorophyll a, (Violaxanthin,)
Lutein, ß-Carotin. ß-Carotin,
Lutein und Chlorophyll a hätten getrennt in Reagenzgläsern aufgefangen werden
sollen. Doch die gelben Farbstoffe Lutein und ß-Carotin ergaben anscheinend nur
eine gemeinsame Bande, so dass erst die Messung des Absorptionsspektrum (siehe
3.) Aufklärung über die tatsächlich aufgefangenen Pigmente liefern würde. 3. Absorptionsspektrum Das
Absorptionsspektrum wurde mit einem selbstregistrierenden Photometer gegen
Benzin ermittelt (siehe beigefügte Graphiken). Zuerst
wurde die Probe der untersten Bande, die wahrscheinlich ß-Carotin und Lutein
enthielt, untersucht. Der Vergleich des Spektrums (Skript) mit dem aufgenommenen
Spektrum zeigt, dass die Maxima der Probe genau denen des Luteins entsprechen.
Man kann aber nicht ausschließen, dass eine geringe Verunreinigung mit ß-Carotin
vorliegt, da die beiden Pigmente in etwa die gleichen Maxima besitzen (425, 450,
475 nm). Die
zweite Probe weist zwei Maxima auf,
bei etwa 420 und 670 nm, was eindeutig bestätigt, dass Chlorophyll a vorlag. 4. Dünnschichtchromatographie a)
Das Farbstoffgemisch wurde auf einer „Kieselgel 60“-Folie aufgetrennt. Dazu
wurden im Abstand von 2 cm portioniert Farbmengen von 3, 18 und 90 µl
aufgetragen, so dass das Lösungsmittel vor weiterem Auftrag erst verdampfen
konnte. So entstanden drei kleine Auftragstellen mit steigenden Mengen, wodurch
ein Verwischen der einzelnen Bandengrenzen bei eventuell zu hoher Menge
vermieden werden sollte. Die Platte wurde in eine mit Laufmittel gefüllte
Trennkammer gestellt. In den nächsten 1,5 h stieg das Laufmittel langsam von der Startlinie empor und zog die einzelnen Farbstoffe
entsprechend ihrer Polarität mit unterschiedlicher Geschwindigkeit mit. Folgendes
Trennungsbild sollte sich ergeben: Neoxanthin,
Violaxanthin, Lutein, Chlorophyll b, Chlorophyll a, Phaeophytin a, ß-Carotin. Tatsächlich
waren bei der höchsten Substanzmenge nur vier Banden zu sehen: vermutlich
Lutein, Chlorophyll b, Chlorophyll a, Phaeophytin. Bei
mittlerer Menge ergaben sich nur zwei Banden, wahrscheinlich die beiden
Chlorophylle, und bei 3 µl zeigte sich gar keine Bande. Die
Pigmentkonzentration unserer Lösung war anscheinend sehr niedrig, so dass es
vielleicht sogar sinnvoll gewesen wäre, noch mehr aufzutragen. b)
Im Trennungssystem mit reversen Phasen wurden die Proben auf den nicht imprägnierten
Teil der Platte aufgetragen. Dieser Teil wirkt als Konzentrierungszone, so dass
die Pigmente als scharfe Zone bis zur Imprägnierung mitgenommen werden. Danach
wurden sie aufgetrennt, und zwar in umgekehrter Reihenfolge wie oben. Auf
Grund der geringen Pigmentmenge waren nur drei Banden zu erkennen: Lutein,
Chlorophyll b, Chlorophyll a Die
vorhandenen Banden waren dünn und balkenförmig im Gegensatz zur obigen Methode
(a), wo es sich bei den Banden eher um runde Flecke handelt, die leicht
ineinander übergehen können. Nur
zur Auftrennung sind die Dünnschichtchromatographien sicherlich besser
geeignet, da die Banden deutlicher sind. Will man aber die Substanzen weiter
untersuchen, müsste man sie umständlich vom Träger eluieren. In diesem Fall
stellt die Säulenchromatographie die bessere Alternative dar, da größere
Mengen des Farbstoffs einfach aufgefangen werden können. Versuch IX B: Ionenaustausch-Chromatographie von
Phycobiliproteinkomplexen des Cyanobakteriums Mastigocladus
laminosus an DEAE-Säulen Phycobilisomen
der Cyanobakterien sind als supramolekulare Komplexe an der Außenseite der
Thylakoidmembranen gebunden, wo sie mit den Photosystem II-Komplexen assoziiert
sind. Sie
bestehen aus verschiedenen Untereinheiten: dem Allophycocyanin(AP)-zentrum („core“)
und peripher angeordneten „rods“, die Phycocyanin (PC) und oft auch
Phycoerythrin (PE) bzw. Phycoerythrocyanin (PEC) enthalten. Die Einteilung in
diese verschiedenen Klassen erfolgte entsprechend ihrer spektralen
Eigenschaften. Der
Versuch wurden mit Hilfte eines Diethylaminoethyl (DEAE)-Anionenaustauschers
durchgeführt. Als stationäre Phase diente DEAE-Trisacryl, als mobile Phase 10
mM Diammoniumhydrogen-Phosphat-Puffer. Die
Probe, bestehend aus Phycobilisomen-Dissoziat von Mastigocladus laminosus, wurde nun auf die Säule aufgetragen.
Anschließend konnte mit den Elutionen begonnen werden. Die einzelnen Fraktionen
wurden in Eppendorf-Cups aufgefangen. 1. Elution
(10 mM (NH4)2HPO4): PEC (rosa) 2. Elution (30 mM (NH4)2HPO4): AP (hellblau) 3. Elution (400 mM (NH4)2HPO4): PC (dunkelblau) Danach
musste die Säule wie im Skript beschrieben regeneriert werden. Die
Proteinfraktionen konnten im automatischen Spektrometer an Hand ihrer
Absorptionsmaxima identifiziert werden (siehe beigefügte Graphiken): 1. Elution
(Graphik verkehrt herum, da Probe und Referenz vertauscht wurden): PEC
Emax : theoretisch ca. 575 nm, gemessen: ca. 590 nm 2. Elution: AP
Emax : theoretisch ca. 650 nm, gemessen: ca. 610 nm Das
gemessene Maximum weicht beträchtlich vom Idealwert ab, evtl. liegt eine
Verunreinigung vor oder der Wert wurde durch ein Trockenlaufen der Säule verfälscht. 3.Elution: PC
Emax : theoretisch ca. 620 - 630 nm, gemessen: ca. 560 nm Der
falsche Wert resultiert hier wahrscheinlich aus einer Verunreinigung der Probe
mit PE, dessen Emax bei
550 - 575 nm liegt. ________________________Versuch 9: Chromatographie
A: Isolierung und Chromatographie der
Chloroplastenfarbstoffe DurchführungBlätter werden mit CaCO3 (Puffer), Benzin und Aceton (anaerob) zerkleinert und abfiltriert. Die Pigmente werden im Scheidetrichter von der wässrigen Phase (Saft mit NaCl) in die Organische Phase (Benzin) überführt. Das restliche Aceton wird ausgewaschen, und das Wasser mit Na2SO4 entfernt. a) Säulenchromatographie: Die Farbstofflösung wird auf eine mit Stärke gefüllte Säule aufgebracht und mit Entwicklergemisch getrennt. Die Banden mit ß-Carotin, Lutein und Chlorophyll a sollten aufgefangen werden, die ß-Carotin-Bande war aber nicht sichtbar. b) Dünnschichtchromatographie Die Farbstofflösung wird auf eine Kieselgel 60- Folie und auf den nicht-imprägnierten Teil einer Folie aufgetragen bei der mit Reversen Phasen getrennt wird. Beide Folien werden in Schwachlicht in Feuchtigkeitskammern in der jeweiligen Laufmittellösung gestellt. c) Absorptionsspektrum Von den aufgefangenen Proben aus a) wird ein Absorptionsspektrum zwischen 400 und 500 nm erstellt. Ergebnis b) Die Probe auf der Kieselgel-60 Folie zeigte die Banden in folgender Reihenfolge: -
Start -
Neoxanthin -
Violaxanthin -
Lutein - Chlorophyll II b - Phaephytin b (nicht gut getrennt, war bei Chlorophyll II b dabei) -
Chlorophyll IIa -
Phaephytin a -
Carotin ß Leider ist der Streifen völlig verblasst, so dass man jetzt überhaupt nichts mehr darauf sieht. Das Reverse Phasen-System zeigt kaum erkenntliche gelb-grünliche Flecken, keine Banden. c) Absorptionsspektrum siehe Anlage I und II (Ausdruck) Diskussion b) Die Auftrennung der Banden bei der ersten Folie gelang mustergültig, nur Chlorophyll II b und Phaephytin b lagen übereinander und gaben eine Mischfarbe. Wären die Proben noch etwas länger gelaufen, hätte sich das auch noch aufgetrennt.4 Die Reverse Phase ist beim einlegen leider kurz in die Lösung gefallen, weswegen wohl die Probe etwas verwaschen wurde. c) Die erhaltenen Absorptionsspektren entsprechen relativ gut den Bekannten Eigenschaften der Isolierten Stoffe. Das zweite Maximum bei Chlorophyll b liegt bei 650 nm und ist nicht mehr auf dem Ausdruck enthalten. Beim Lutein ist bei 480 nm ein eigenartiger Einbruch, ansonsten entspricht auch dieses Spektrum den bekannten Absorptionseigenschaften. a) Dies lässt darauf schließen, dass die Auftrennung bei relativ gut gelungen ist (außer bei ß-Carotin) B: Ionenaustausch-Chromatographie von
Phycobiliproteinkomplexen des Cyanobakteriums Mastigocladus laminosus an
DEAE-Säulen Durchführung Ein fertig gereinigtes Aliquot mit Phycobiliproteinkomplexen wurde auf eine DEAE-Säule aufgetragen. Die Probe wurde dann mit verschiedenen Konzentrationen des Elutions-Puffers (NH4)2PO4 Eluiert, wobei die verschiedenen Fraktionen der Komplexe getrennt wurden. Ergebnis 1.
Elution (10mM
Puffer): Hier sollten die Phycoerythrocyanine eluiert werden, da diese nicht an die Matrix binden. Das Eluat sollte rosa sein, war es aber nicht und wie Anlage I zeigt, ist in der Isolierten Fraktion irgendetwas, jedoch kein PEC vorhanden. 2.
Elution
(30 mM Puffer): Das Eluat wird hellblau, es werden AP eluiert. Absorptionsspektrum siehe Anlage II 3.
Elution (400 mM
Puffer): Hier werden PC isoliert, das Eluat ist dunkelblau. Absorptionsspektrum siehe Anlage III Diskussion Bei der ersten Elution lag offensichtlich Verunreinigung vor, oder die Fraktion wurde zu früh entnommen, so dass die PEC noch nicht da waren. Jedenfalls zeigte das Photometer keine deutliches Absorptionsmaximum. Elution 2 und 3 waren hingegen erfolgreich, die Spektren zeigen Absorptionsmaxima bei 650 nm (für AP) und bei 630 nm (für PC).
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