Versuch 8: Biopolymere III und Biochemie II

  Versuch VIII A: Isolierung und quantitative Bestimmung von Protein aus Kartoffelknollen

Ohne ihre spezifischen Strukturen verlieren Proteine ihre biologische Aktivität. Ziel des Versuchs ist es, die Einwirkung von Hitze, Schwermetall und konz. Salzsäure auf Proteine zu untersuchen. Außerdem soll der Proteingehalt der Kartoffel quantitativ bestimmt werden.

50 g Kartoffel wurde geschält, zerkleinert und im Mixer mit Tris/HCl homogenisiert. Der Saft wurde durch ein Leintuch gepresst und anschließend 5 min zentrifugiert.

Je 2 ml des Überstands wurden dann folgendermaßen behandelt:

1.   Hitzefällung: 5 min erhitzen im kochenden Wasserbad

2.   Schwermetallfällung: Zugabe von 10%igem Zinkacetat

3.   Ammoniumsulfatfällung: Zugabe von 2,4 ml Ammoniumsulfatlösung

Der bei allen Reaktionen entstandene Niederschlag wurde nun abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Beim Versuch, die Sedimente wieder mit Puffer zu lösen, zeigte sich, dass nur die Ammoniumsulfatfällung reversibel ist.

Erklärung:

1.   Durch die Hitze wird die Tertiär- und Quartärstruktur zerstört

=> irreversible Denaturierung

2.   Zink lagert sich ein und zerstört dadurch die H-Brückenbindungen

=> irreversible Denaturierung

3.   Ammoniumsulfat entzieht die Wasserhülle

=>lässt sich durch Puffer wieder regenerieren, reversibler Vorgang

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde eine Eichkurve aufgestellt. Dazu pipettierte man verschiedene Mengen einer Serumalbumin-Lösung (5 mg/ml) in ein Reagenzglas, füllte auf  1 ml auf und gab 4 ml Biuret-Reagenz dazu. Diese enthält Kupferionen, die mit den CO-NH-Gruppierungen einen violetten Komplex ergeben. Mit verschiedenen  Mengen einer 1:2 Verdünnung des Preßsafts wurde genauso verfahren. Die Ansätze wurden 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion der Proben bei 540 nm gemessen.

Eichkurve (fett gedruckt):

Die Verdünnung einberechnet und auf 1 ml hochgerechnet ergeben sich folgende Werte:

Da das gesamte Überstandsvolumen des Preßsafts nicht gemessen wurde, kann der prozentuale Proteingehalt des Kartoffelgewebes (Erfahrungswert ca. 2%) nicht berechnet werden.

Versuch VIII B: Nachweis der Succinat-Dehydrogenase im Rohextrakt keimender Sonnenblumen-Samen

Im Citronensäurezyklus wird der Wasserstoff von Succinat durch die Succinat-Dehydrogenase auf FAD übertragen. Er kann aber auch auf einen Redoxfarbstoff wie das blaue 2,6-Dichlor-phenolindophenol übertragen werden, das im reduzierten Zustand farblos ist.

5 g von drei Tage alten Sonnenblumenkeimlingen wurden mit Phosphatpuffer auf Eis zerrieben. Das Homogenat wurde durch ein Nylontuch gepresst und durch Zentrifugation grobe Partikel entfernt. Thunbergröhrchen wurden wie im Skript angegeben beschickt, d. h. mit Wasser, Puffer, Farbstoff, Succinat und Sonnenblumenextrakt, wobei einmal das Succinat weggelassen wurde und einmal gekochter Sonnenblumenextrakt zugegeben wurde. Es wurde auch noch eine Parallelprobe angesetzt, die sich aber im Ergebnis nicht unterschied. Noch vor Einmischen des Extrakts wurde außerdem evakuiert, um zu verhindern, dass Sauerstoff in die Atmungskette geschleust und sie dadurch blockiert wird. Dann wurden die Röhrchen gekippt und in ein 32°C Wasserbad gestellt.

Im Idealfall hätten sich nach einiger Zeit die Röhrchen mit ungekochtem Extrakt und Succinat entfärben sollen, da der Farbstoff reduziert wird. Bei den anderen Ansätzen hätte es keine sichtbare Reaktion geben dürfen, da in einem Fall das Enzym durch die Hitze denaturiert wurde und im anderen Fall kein Substrat für das Enzym vorhanden war (eine ganz leichte Entfärbung wäre hier durch endogenes Substrat zu erklären). Somit wäre gezeigt, dass die Entfärbung auf die Wirkung der Succinat-Dehydrogenase zurückzuführen ist.

Dieser Nachweis konnte nicht erbracht werden, da die Evakuierung an der Wasserstrahlpumpe fehlschlug und Wasser in die Thunberg-Röhrchen gelangte. Die Entfärbungsintensität konnte so auf Grund der Verdünnung nicht mehr eindeutig bestimmt werden; wenn überhaupt war nur eine geringe Entfärbung des vollständigen Ansatzes erkennbar. Wahrscheinlich wurde die Reaktion auch durch den zu hohen Sauerstoffpartialdruck behindert.

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Versuch 8: Biopolymere III und Biochemie II

A: Isolierung und Quantitative Bestimmung von Protein aus Kartoffelknollen

Durchführung

Protein-Fällung

Aus Gemixten Kartoffeln wurde der Saft ausgepresst, und die darin gelösten Proteine durch verschiedene Verfahren ausgefällt.

-        Probe 1: Fällung durch Hitze (5 min. Wasserbad)

-        Probe 2: Fällung durch Schwermetallionen (Zinkacetat)

-        Probe 3: Fällung durch Ammoniumsulfat

Quantitative Proteinbestimmung:

Es wurde eine Eichgerade mit 6 bekannten Konzentrationen eines Proteins (Serumalbumin) hergestellt. Die Eichproben wurden mit Biuret „angefärbt“ (Kupferionen) und die Extinktion der jeweiligen Konzentrationen mittels Photometer ermittelt.

Anschließend wurde der zu untersuchende Kartoffelsaft auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und ebenfalls mit Biuret-Lösung versetzt. Nach 30 min. wurde die Extinktion gemessen.

Ergebnis

Protein-Fällung

-        Probe 1: Der Niederschlag ist flockig und lässt sich nicht mit Puffer lösen

-        Probe 2: Der Niederschlag ist etwas feiner und lässt sich ebenfalls nicht lösen

-        Probe 3: Der Niederschlag lässt sich leicht lösen.

Quantitative Proteinbestimmung

1.     Extinktionswerte der Eichproben mit Serumalbumin

Anlage 1. zeigt die Werte aus Tabelle 1 und 2 Graphisch dargestellt

2.     Extinktionswerte der Testproben aus Kartoffelsaft

Damit ergeben sich folgende Konzentrationen:

0,25 ml einer 1:2 Verdünnung entsprechen (laut Eichgeraden) 0,525 bzw. 0,61 ml Serumalbumin (5 mg/ml)

-        0,525 *5 * 3 = 7,87 mg Protein in 0,25 ml Kartoffelsaft

-        0,61 *5*3 =  9,15 mg Protein in 0,25 ml Kartoffelsaft

0,5 ml einer 1:2 Verdünnung entsprechen 0,68 ml Serumalbumin

-        0,68*5*3 = 10,2 mg Protein in 0,5 ml Kartoffelsaft

1,0 ml entsprechen 0,8 bzw 0,85 ml Serumalbumin

-        0,8*5*3 = 12 mg Protein in 1 ml Kartoffelsaft

-        0,85*5*3 = 12,75 mg Protein in 1 ml Kartoffelsaft

Durchschnittlich sind im Kartoffelsaft 22 mg Protein/ml

Diskussion

Proteinfällung

Da die Proteine durch Hitze und Schwermetallionen irreversibel denaturiert werden, können sie auch nach Entfernen des Fällungsmittels nicht mehr in Lösung gebracht werden. Die genannten Mittel brechen kovalente Bindungen auf bzw. bilden unlösliche Komplexe mit den Proteinen.

Ammoniumacetat dagegen entzieht den gelösten Proteinen lediglich die Hydrathülle und fällt sie somit aus, ohne sie irreversibel zu denaturieren. Deshalb lässt sich diese Probe nach entfernen des Ammoniums ohne weiteres wieder lösen.

Quantitative Proteinbestimmung

Die Werte für die verschiedenen Konzentrationen des Saftes fallen recht unterschiedlich aus. Dies liegt vermutlich an einer Unregelmäßigkeit bei der Eichgeraden, möglicherweise ein Pipettierfehler.

B: Nachweis der Succinat-Dehydrogenase im Rohextrakt keimender Sonnenblumen-Samen

Durchführung

Sonnenblumenkeimlinge werden bei pH7 zerkleinert, ausgepresst und abzentrifugiert. Der Überstand wird in 6 Thunberg-Röhrchen verteilt und mit 2,6-Dichlorhenolindophenol und Succinat versetzt.

Der Farbstoff kann von Succinat-Dehydrogenase aus dem Zitronensäurezyklus unter (möglichst) anaeroben Bedingungen reduziert werden und ist dann farblos.

In zwei Proben wurde der Sonnenblumenextrakt abgekocht, in zwei weiteren wurde kein Succinat zugegeben.

Nun werden die Röhrchen evakuiert, damit der O₂-Partialdruck sinkt, und der Farbstoff nicht zurückoxidiert wird. (auch Succinat und Enzym werden leicht oxidiert). In unserem Fall war das Evakuieren etwas problematisch, da die Pumpe nicht richtig funktionierte und dadurch eine Probe vernichtet wurde und neu angesetzt werden musste.

Ergebnis

Diskussion

Probe 5 +6 weisen nach, dass es sich bei den Molekülen, die die Reaktion bewerkstelligen um Proteine handelt. Wie im Versuch A schon gezeigt, denaturiert Hitze die Proteine, und ohne sie läuft keine Reaktion mehr ab.

Mit den Proben 3 + 4 zeigt man, dass es sich bei dem Substrat für das Enzym um Succinat handeln muss. Die Reaktion läuft ohne zusätzliches Succinat wesentlich schwächer ab. Dass überhaupt eine Reaktion zustande kommt liegt daran, dass sich auch noch Succinat in dem Zellextrakt befindet.

Bei Probe 1+2 funktioniert die Reaktion erwartungsgemäß.

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