Versuch 7: Biopolymere II

Versuch VII A: Amplifikation von ausgewählten DNA-Regionen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Mittels der PCR lassen sich in einer exponentiellen Kettenreaktion sehr schnell sehr viele Kopien einer DNA-Region herstellen, von der nur die flankierenden Sequenzen bekannt sein müssen.

Mit Hilfe entsprechender Primer sollten je eine plastidäre und eine mitochondriale Genregion amplifiziert werden.

Dazu wurden drei verschiedene Pflanzen-DNA-Proben X,Y und Z mit einer dNTP-Mischung, mit Taq-Polymerase und mit je einem Primerpaar für die jeweils plastidäre und mitochondriale Sequenz angesetzt (genauer Ansatz siehe Skript). Desweiteren wurde eine Pufferkontrolle angesetzt.

In die PCR-Maschine wurde nun ein 32 Zyklen umfassendes Programm eingegeben, wobei ein Zyklus folgende Teilschritte enthält:

20 sek bei 95°C: die DNA wird denaturiert, um sie in ihre Einzelstränge zu zerlegen

30 sek bei 55°C: hier erfolgt das „primer-annealing“, d.h. die Primer werden an die DNA hybridisiert

60 sek bei 72°C: die Polymerase synthetisiert die DNA mit den dNTPs von den Primern an

Die anschließende Gelelektrophorese sollte Aufschluß geben über die Größe der amplifizierten Fragmente.

Versuch VII B: Extraktion von Plasmid-DNA aus Escherichia coli

Plasmide sind ca. 3 bis 4 kb lange, zirkuläre doppelsträngige DNA-Moleküle, die meist im Cytoplasma von Bakterien vorkommen.

Für die Extraktion wurden die abzentrifugierten Bakterien in Lösung resuspendiert. Durch die Zugabe von NaOH und SDS wurden die Proteine und die DNA denaturiert. Dabei mußte darauf geachtet werden, dass nicht zu lange unter alkalischen Bedingungen inkubiert wurde, da sonst die Plasmide irreversibel denaturiert würden. Mit Kaliumacetat konnten die Plasmide anschließend renaturiert werden, nicht jedoch die große chromosomale DNA. Chloroformzugabe löst unpolare Lipide und lässt das DNA-Protein-Kalium-SCS-Gemisch besser pelletieren, das im Anschluß abzentrifugiert wurde. Die Plasmide konnten dann durch Mischen mit Ethanol als Pellet isoliert werden.

Durch Gelelektrophorese sollte der Unterschied im Laufverhalten sichtbar gemacht werden.

Auswertung des Gels:

Versuch VII A:

Die amplifizierten Genregionen der verschiedenen Pflanzen haben folgende Größen:

Es wurde vergessen, Standard-DNA aufzutragen. Dennoch sind einige Schlußfolgerungen möglich.

Die Bande 2 enthält amplifizierte Fragmente der Genregion A. Daher ist eindeutig, dass es sich um die 1,1 kb Bande handelt. Bahnen 3 und 4 zeigen zwei kleinere Fragmente, hier handelt es sich um 380 bzw. 450 bp. Offensichtlich wurde als erstes Mais aufgetragen. Auf die 4. und 5. Bahn Spinat, was man wegen der 450 bp Bande erkennen kann, trotz fehlender 1000 bp Bande. Die PCR beim Tabak brachte kein erwartungsgemäßes Ergebnis, da auf den Bahnen 6 und 7 die Auftrennung ausblieb.

Die Pufferkontrolle, die keine zu amplifizierende DNA enthielt, zeigt wie erwartet auch keine Banden. Es sind nur dunkle Flecken zu sehen (wie auch bei einigen anderen Bahnen), die aus nicht eingebauten Primern und Nukleotiden bestehen.

Versuch VII B:

Die erste Bahn zeigt Plasmid-DNAs. Man kann ihre Größe nicht an Hand normaler Standard-DNAs messen, da sie auf Grund ihrer Formen ein unterschiedliches Laufverhalten aufweisen. So ist die oberste Bande wahrscheinlich „supercoiled“, wodurch sie leichter durch die Maschen des Gels wandern kann. Die andere Bande ist langsamer gelaufen, deren Fragmente sind demnach linear („nicked“).

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Versuch 7: Biopolymere II

A: Amplifikation von Ausgewählten DNA-Regionen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Durchführung

Es wurden drei verschiedene DNA-Proben (X, Y, Z) in den PCR-Ansatz (Zusammensetzung siehe Skript) gegeben. Jede Probe wurde einmal mit den A1A2-Oligonukleotiden und einmal mit den B1B2-Oligonukleotiden angesetzt, d.h. es wurden je zwei verschiedene Genregionen amplifiziert.

Außerdem wurde ein Kontrollansatz mit Wasser (statt DNA) gemacht.

Alle Probe wurden in den PCR-Automaten gegeben und ca. 90 min. lang amplifiziert (32 Zyklen).

Ergebnis

Die Probelösungen sollten am nächsten Kurstag auf ein Gel aufgetragen werden. Sie sind aber in den Tiefen der Kühltruhe verschollen, - ohne DNA kein Gel – ohne Gel kein Bild.

B: Extraktion von Plasmid-DNA aus Escherichia Coli

Durchführung

Bakterienzellen von E. coli wurden Aufgeschlossen (NaOH, SDS) und Proteine sowie genomische DNA ausgefällt (Kaliumacetat, Chloroform).  Das Pellet wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die gelöste Plasmid-DNA mit Ethanol gefällt (entzieht Hydrathülle).

Ergebnis/Diskussion

Die Plasmidische DNA fällt durch das Ethanol aus und ist als weißlicher Niederschlag sichtbar.

Der Versuch verlief erfolgreich. Die isolierten Plasmide könnte man nun zu Klonierung verwenden, oder auf einem Agarosegel weiter analysieren. In unserem Fall ging es aber nur um die Isolierung, das Resultat wurde verworfen.

Die genomische DNA kann deshalb von der plasmidischen DNA getrennt werden, weil die Plasmide  nach der Denaturierung durch NaOH schnell rezirkularisieren, während Genom-DNA denaturiert bleibt und deshalb mit SDS und Kalium Komplexiert.

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