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Versuch 6: Biopolymere I Versuch VI A: DNA-Extraktion aus
einem Bakterium (Prokaryont) In
Eukaryonten befindet sich die Hauptmenge der DNA in den Chromosomen im Kern. Darüber
hinaus befindet sich gemäß der Endosymbiontentheorie auch in den Organellen
(Mitochondrien und Plastide) DNA. In Prokaryonten ist die DNA in einem einzigen
zirkulären Chromosom lokalisiert. a) Extraktion
von Gesamtzell-DNA aus Escherichia coli Die
abzentrifugierten Bakterien wurden in Kochsalz-EDTA-Lösung (Hemmung der DNase)
aufgeschlämmt und die Zellwand mittels Lysozym im Wasserbad lysiert. Die
Behandlung mit SDS-, SSC-Lösung und Phenol und anschließende Zentrifugation
diente dem Zweck, die DNA von den Proteinen zu trennen. Mit einer
Chloroform-Isoamylalkohol-Mischung konnten restliche Peptide und Lipide
abzentrifugiert werden. Die nun im Überstand vorhandene DNA wurde eisgekühlt
vorsichtig mit Isopropanol überschichtet. Dadurch wurde der DNA die Hydrathülle
entzogen und ihre Fällung bewirkt. Nachdem sie dann abzentrifugiert, mit
Ethanol gewaschen und getrocknet wurde, löste man sie in Wasser zurück und
stellte sie auf Eis. b) Extraktion
von pflanzlicher Gesamtzell-DNA Wegen
der widerstandsfähigen Zellwände musste das Pflanzenmaterial zuerst mechanisch
unter Zugabe von flüssigem Stickstoff zerkleinert werden. Zum Zellaufschluß
wurde das Blattmaterial mit CTAB inkubiert, das Stärkemoleküle ummantelt,
Proteine denaturiert und Nukleasen hemmt. Diese Substanzen, Lipide und Peptide
wurden anschließend mit Chloroform/Isoamylalkohol gefällt. Weiterhin wurde mit
Isopropanol und Ethanol gemischt und jeweils zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das Sediment wurde luftgetrocknet, in Wasser rückgelöst und in Eis
aufbewahrt. Versuch
VI B: Restriktion von DNA-Fragmenten Restriktionsenzyme
erkennen Palindrome und erzeugen beim Schnitt entweder „blunt ends“ oder „sticky
ends“. Die so erzeugten DNA-Fragmente können mittels Gelekektrophorese
aufgetrennt werden. Der
Plasmidvektor pBluescript KSII+, der ein Insert enthält, und Pflanzen-DNA
sollte mit PvuII verdaut werden. Dazu wurden die Restriktionsansätze (siehe
Skript) im Eisbad zusammen pipettiert. Während 1-2 h im Wasserbad erfolgte der
Verdau. Anschließend konnte die DNA durch Gelelektrophorese aufgetrennte werden
(Versuch VI C). Versuch
VI C: Elektrophorese von DNA auf Agarosegelen Agarosegele
lassen sich sehr variabel herstellen, da sich je nach Agarosekonzentration ein
unterschiedlicher Trennbereich für die DNA-Moleküle ergibt. Für
das Minigel wurde eine 0,8%ige Agarosekonzentration gewählt. Die Agarose wurde
mit TBE-Puffer, bidestilliertem Wasser und der interkalierenden Reagenz
Ethidiumbromid gemischt und erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 50°C wurde das Gel
eingegossen und der Probenkamm an der Kathodenseite eingelegt, da die negativ
geladene DNA zur Anode läuft. Das
getrocknete Gel wurde mit Elektrophoresepuffer überschichtet. Die
mit Probenpuffer versetzten Proben sowie Standard-DNA wurden anschließend ins
Gel eingebracht. Die Fragmente wurden dann 1-2 h bei 70 V laufen gelassen. Auf
dem anschließend gemachten Photo lässt sich an Hand der Standard-DNA abschätzen,
dass die beiden Fragmente des Plasmids etwa 2,2 kb groß sind (Bahn 2). PvuII
schneidet das 3 kb große Plasmid ohne Insert in ein 2,2 kb und ein 0,8 kb
langes Fragment. Daraus kann man schließen, dass das Insert 1,4 kb lang ist und
in das kürzere Fragment eingefügt ist. Bahn
1 zeigt unverdaute selbst isolierte Pflanzen-DNA. Das Verwischen der Bande kommt
evtl. dadurch zu Stande, dass die DNA während der Isolation in viele Bruchstücke
zerfallen ist. In
Bahn 3 wurde mit Restriktionsenzymen verdaute Pflanzen-DNA aufgetragen. Doch kam
es hier anscheindend zu keiner Verdauung, da die DNA nicht aufgetrennt wurde.
Ihre Größe beträgt über 10 kb. In Bahn 6 wurde verdaute Bakterien-DNA pipettiert. Auch hier kam es zu keiner Restriktion, die unverdaute DNA ist größer 10 kb. Eventuell wurde das Restriktionsenzym unsachgemäß behandelt oder nicht lange genug verdaut. Der Schleier entspricht aufgetrennter RNA. _____________________________Versuch 6: Biopolymere I A: DNA-Extraktion aus einem Bakterium und aus einer höheren
Pflanze DurchführungUnsere Gruppe (a) extrahierte DNA aus einer ÜK von E.coli. (Oder versuchte es zumindest). Dazu wurden die Zellen mit EDTA, Lysozym und SDS aufgeschlossen, und die Proteine mit SDS bzw. Phenol ausgefällt und von der DNA abgetrennt. Die gelöste DNA sollte dann mit Isopropanol gefällt werden. Dabei ist die Probe leider im „ewigen“ Eis verloren gegangen. Da jede Gruppe eine andere DNA-Extraktion durchführt, konnten wir auch keine Ersatz-DNA für die anschließende Gel-Elektrophorese benutzen. An diesem Punkt endet der Versuch. - Sorry- Ergebnis/Diskussion Unter normalen Umständen hätte sich an der Phasengrenze zwischen Alkohol und Wasser ein weißliches DNA-Kondensat niedergeschlagen, welches man auf eine Pipettenspitze aufwickeln kann. Dies liegt daran, dass der Alkohol der DNA die Hydrathülle entzieht, und sie damit unlöslich wird. Die gefällte DNA hätte man durch Zentrifugation abgetrennt und auf ein Gel aufgetragen. Die erhaltenen Fragmente sollten eine Größe zwischen 3 und 4 MBp haben. B: Restriktion von DNA-Fragmenten Durchführung Plasmid-DNA und Pflanzen-DNA wurden mit der Endonuclease PvuII versetzt, 90 min bei 37°C inkubiert und anschließend auf ein Gel aufgetragen. (Versuch C). Dabei wurden die im Skript angegebenen DNA-Mengen jeweils halbiert. 10 Einheiten Restriktionsenzym (U=Unit) entspricht 1 Mikroliter. C: Elektrophorese von DNA auf Agarosegelen Durchführung Die Agarose wird in der Mikrowelle verflüssigt, mit Ethidiumbromid und Wasser gemischt und in zwei Minigele gegossen. Leider wurde das anschließende Überschichten mit Puffer vergessen. (nicht unser Tag heute). Ein Teil der Proben wurde dann aufgetragen, ohne dass Spannung angelegt wurde (da wir noch auf die Proben einer anderen Gruppe warten mussten), was dazu führte dass sie etwas austrockneten, deshalb ist die geschätzte DNA-Menge möglicherweise verfälscht. Auf dem Gel wurde eine Marker-DNA, die isolierte Pflanzen-DNA aus Versuch A, zwei Bahnen verdauter Pflanzen-DNA und zwei Bahnen verdaute Plasmid-DNA (aus Versuch B) aufgetragen. Ergebnis Anlage I zeigt ein Photo des Gels nach ca. 90 min. Anlage II zeigt eine Skizze des geschnittenen Plasmids mit Insert. Diskussion Die unverdaute Eukariontische DNA ist ziemlich weit oben lokalisiert (Bahn 2). Bei der verdauten DNA (Bahn 3,4) sieht man auf gleicher Höhe eine Bande, aber viel schwächer, darunter ein „Schmier“, der dafür spricht, dass die Verdauung funktioniert hat. Die breite Front im unteren Teil der Bahnen 2-4 besteht aus RNA-Fragmenten. Die Plasmide wurden deutlich sichtbar in 3 Teile geschnitten, ein großes, zwei kleinere. Da die Werte der Marker-DNA (1 KB-Ladder) nicht vorlagen, kann die größe der Inserts nur ganz grob auf 400-500 kbp geschätzt werden.
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